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工艺详解 | 关于PCR诊断试剂的冻干思考


聚合酶链式反应 (PCR) 是分子生物学中广泛使用的一种方法,用于制作特定DNA片段的多个拷贝。PCR能够使特定目标/测试样本的少量(低至单个拷贝)DNA以指数方式扩增,以生成数千到数百万个拷贝的特定DNA片段。如果目标样品是RNA,也可以添加前体逆转录过程 (RT-PCR)RT过程首先将RNA转化为DNA,然后通过PCR过程对DNA进行扩增。


 


以下是经典PCR方法中涉及的典型试剂和组分以及它们各自所起的作用:


1核苷酸(例如:三磷酸核苷,dNTP——是用于制造新DNA的分子构件,即原材料

2

I. (Taq) DNA聚合酶——驱动DNA复制过程所需的酶;

II.逆转录酶——将目标RNA转化为DNA所需的酶;

3引物——合成DNA寡核苷酸所需的短的单链DNA/RNA片段,有专门设计以适配目标 DNA区域的侧翼。它们为DNA合成提供了起点。一般需要两个引物,分别用于目标区域的两侧;

4检测探针或染料

I. 探针——荧光标记的寡核苷酸

结合每个引物的下游区域。一般需要两种不同的探针,当它们都连接到特定的DNA片段时则会发出荧光,以在扩增过程中提供可检测的指示信号;

II. 染料——DNA存在时会发出荧光,以在扩增进行时提供可检测的指示信号;

5其他赋形剂,如MgCl2辅因子、pH缓冲液、甘露醇、海藻糖、BSAPEG2000等;

6目标DNA/RNA

I. 对于诊断试剂盒,指的是试剂盒正在检测并准备复制的目标DNA(来自病毒、细菌等);或者从被测样品中进行提取(如果可行的话);

II. 用于研究/实验室工作——要复制的特定DNA



PCR方法存在的处理挑战

PCR 方法存在许多处理挑战。各个组分需要在96孔板或鸡尾酒离心管中进行准确组合。这些组分都需要冷藏,并且保质期也相对较短,同时交叉污染会是一个大问题。更糟糕的是,工作台移液错误也会造成麻烦。

标准PCR过程需要特定的热循环重复加热/冷却反应试管30-40个循环,以实现DNA的扩增过程。扩增仪也应该有一个荧光计来监测扩增的目标DNA

另外还有一些更新的扩增方法,例如环介导 (LAMP) 和重组酶聚合酶扩增 (RPA) ,这些方法是等温过程,不需要热循环和使用特殊设备。


 

                           图1PCR扩增热循环仪


较新的技术则是将试剂加载到微流体通道/芯片上。以更少量的试剂和更低热量有望实现更快和更准确的温度循环,从而产生更快的结果。

                                             图2:微流控PCR芯片


PCR&冷冻干燥

冷冻干燥已成为PCR过程的一个重要流程,主要用于单个试剂和最终产品检测试剂盒的生产。研究表明,PCR 扩增效率通常不会由于单个试剂或PCR诊断试剂盒使用了冻干而受影响。虽然冻干可能会使探针的荧光强度略有下降,但并不影响整个测量过程。

冻干PCR产品追求1-3%的最终水分含量。建议通过 Karl-Fisher 滴定法测量水分。

冻干PCR 试剂和诊断试剂盒具有很强的吸湿性。从冻干机中取出产品时,必须小心避免暴露在环境湿气中。湿度受控的房间或隔离设备可用于减缓水分的再吸收。对于产品的储存和运输,试剂必须密封在防潮容器中,例如铝袋。

冷冻的聚合酶和逆转录酶可能含有高达50%的甘油作为冷冻保护剂和稳定剂。甘油不利于冻干,因为它会干扰水分的去除,从而影响产品的稳定性和结构。因此冻干时要注意优先选择不含甘油的试剂。


冻干PCR


 


用于PCR试剂的冻干设备须知


由于测量的试剂样品量以微升为单位,一批次冻干PCR试剂中的总水分含量非常小。冷冻干燥机设计不需要具有1:1的搁板表面与冰冷凝器表面积比,因为这主要用于高水分、散装液体或西林瓶应用。


当产品样本大小在微升范围内时,是很难使用产品探针的。因此在工艺开发时,皮拉尼/电容压力计压力差比较法是更为推荐的干燥终点工具。如果冻干机配备隔离阀且能够实现自动开启和关闭,也可以使用压力升法进行测试。


另外,冻干机中的制冷系统也应考虑精准优化(与常识保留冗余的设计理念相反),较小的压缩机可以大大减少室内热量的消耗。这意味着对于电压和能源占用较小。风冷的中试型冻干机型号更适用于中等批量的诊断试剂的生产和研发,这避免了对冷却水设施的需求,因为冷却水设施对于大部分PCR试剂盒生产场地而言中可能并不容易获取。


SP Scientific VirTis Ultra系列冻干机非常适合诊断应用。它以紧凑的配置提供超过2平方米的搁板面积。这使得客户在样品处理中具有很大的灵活性。


 

          图3SP VirTis Ultra 中试和小型生产冻干机



PCR诊断检测试剂盒的冻干工艺须知


冻干PCR诊断试剂盒的明显优势是消除了试剂盒冷藏运输和储存的冷链依赖,延长了其可用保质期。

96孔板是用于PCR诊断试剂盒的标准配置。相比较手动进样这种繁琐的操作,使用自动化液体灌装设备,除了更快的装载时间和更高的吞吐量外,它还提供更好的过程控制和可重复性。

在批量装载到冻干机的过程中,控制产品的蒸发和产品温度会是一个问题,特别是对于具有较大批量的较大装置,完全装载需要比较长的时间。对搁板进行预冷上会降低上述问题带来的影响。如果加载到芯片或微流体通道上,那么蒸发和传热又会是一个大问题。

冻干过程取决于足够的热量传递到产品中。大多数96孔是塑料管,底部与冷冻干燥机搁板接触的表面积很小。在冷冻干燥过程中可以使用铝制冷却块来增加传导热传递。


 

                              图4:用于 96 孔的铝质传热模具


对流传热在冻干中也很重要,因为它可以帮助产品在货架上更均匀地分配热量,减轻由辐射传热差异引起的边缘效应。在产品支持的前提下,使用更低的真空度(例如:100mTorr 而不是 60mTorr)将提供更均匀的对流传热。然而,许多PCR试剂的塌陷温度非常低,因此冻干过程中设置较高的压力可能并不总是可行的。可以在配方中添加赋形剂,提高塌陷温度,以允许更高的压力设置。这样做的其他好处包括使配方更容易转移到其他可能无法实现非常低真空设置的冻干机(减少工艺放大的风险),以及减少阻塞流现象发生的概率。


出于信号校准的目的,诊断试剂盒通常包含不含目标DNA/RNA的阴性对照混合物和含有目标DNA/RNA的阳性对照混合物。除了包含测试样品的混合物之外,还分析对照样品,并比较荧光信号以确定患者样品是阳性还是阴性。处理阳性对照样品的一个问题是冻干机内部存在交叉污染的高风险。因此建议客户分别使用多个冻干机,阳性对照始终在同一设备中进行处理。



单个PCR试剂源材料的冷冻干燥


除了延长保质期和避免对供应冷链的需求外,实验室使用冻干PCR试剂的其他好处包括:


●   更稳健的工艺,更高的可靠性和更少的批次变化,因为冷冻干燥大大降低了实验室工作台移液错误和污染的可能性;


●   避免多次冻融循环的破坏性影响;


●   减少设置和处理时间;


●   减少过期产品的浪费,降低运输和储存成本。


为方便起见,预配制的冻干PCR“Master-Mix”试剂目前也可在市面上进行购买,它可以通过消除实验室工作台上的一些混合步骤来提高通量。主混合物通常包含核苷酸、酶、辅因子和缓冲液。



冻干微珠

一些 PCR 试剂供应商在实验室实验中采用的一种常见方法是提供冷冻干燥的试剂预混珠,在冻干之前使用专门的设备用液氮冷冻。


 

                           图5:冻干 PCR 微珠


在冻干之前使用液氮预冻试剂存在权衡取舍。极快的冷冻速度可最大限度地减少冷冻浓度效应,例如pH变化。然而,它也会带来非常小的冰晶尺寸,这会导致在干燥过程中对蒸汽流动的阻力更大并且干燥时间更慢。PCR的小样本量可以降低这方面的影响,但需要冻干机提供更冷的搁板温度和更低的真空度来防止珠子在初级干燥过程中熔化。

此外,珠子必须保持冷冻。可以使用冷藏的冷盘来辅助。冷冻干燥机搁板也需要预冷,以避免产品在抽真空之前熔化。要注意的是在产品室门在真空下密封之前,预冷冻搁板会导致环境条件下结霜。

冷冻干燥的颗粒或珠子通常放置在PCR管中,然后密封在防潮袋中。

综上所述,PCR诊断试剂的冻干需要考虑多种因素,其中包括商用原料的类型和冻干机的选用。莱奥德创可以为客户提供一站式诊断试剂冻干工艺解决方案,从配方的设计到商业化生产阶段均可为客户提供快速、可靠的委托服务。


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